根據(jù)培養(yǎng)過程中是否需要分割培養(yǎng)物進行再培養(yǎng)而將細胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。
一、原代培養(yǎng)
（一）過程
原代培養(yǎng)的基本過程包括取材、培養(yǎng)材料的制備、接種及培養(yǎng)等步驟。原代培養(yǎng)的方法很多，基本和**常用的是組織塊培養(yǎng)法和分離細胞法。
1、組織塊培養(yǎng)法
(1)基本操作過程
1）、用培養(yǎng)液濕潤所取組織材料，并用鋒利的眼科剪將附在其上的脂肪和結締組織去除干凈。再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用鋒利的眼科彎剪將組織塊剪成小塊；再用PBS或Hanks液漂洗多次，直**液體不渾濁、無油滴、清亮為止。
2）、用濕潤的吸管吸取切碎的組織塊，清清吹到培養(yǎng)瓶皿中，并將其按一定間距均勻放在培養(yǎng)瓶底壁上，量不要過多，要將組織塊切面貼在培養(yǎng)瓶底壁上；
3）、將培養(yǎng)瓶翻轉，使瓶底朝上，在種植了組織塊一側的對側面加足培養(yǎng)液，勿使組織塊與培養(yǎng)液接觸，塞緊瓶塞；
4）、將種植了組織塊的一側朝上，靜置于37℃培養(yǎng)箱中；待組織塊貼壁1h到3h后翻瓶，使貼壁的組織塊浸沒與培養(yǎng)液中，靜置；
5）、每隔2到3天更換一次培養(yǎng)液，或者根據(jù)培養(yǎng)瓶種顏色的變化確定換液時間。
2、注意事項
1）、組織塊接種后的前3天，從組織塊向外遷徙的細胞數(shù)很少，組織塊的黏附不牢固，在觀察和移動的過程中，注意不要引起液體的振蕩。要避免經常翻動和振動，否則組織塊不易附著于瓶壁上或附著后也會脫落飄起。
2）、加入的培養(yǎng)液不宜過多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動而脫落下來。
3）、用組織塊培養(yǎng)時，要及時觀察，當細胞向外遷徙出來后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細胞，因為已漂浮的組織塊和那些細胞碎片已經死亡，它們產生的有毒物質會影響原代細胞的生長，要及時清除。
4）、為促進組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上，可以在種植前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。細胞培養(yǎng)過程中，膠原中的促細胞貼附因子先吸附于培養(yǎng)瓶底壁上，懸浮的圓形細胞再與已吸附有促貼物質的底壁附著。
2、分離細胞培養(yǎng)法—貼壁型細胞培養(yǎng)
（1）基本操作過程
1）、shou先用細胞分散法收獲細胞，隨時吸取少量消化液在鏡下觀察，并根據(jù)組織是否分散成細胞團或單個細胞，采取終止消化措施。用篩網濾掉未消化的組織塊。
2）、低速離心細胞懸液，棄掉上清液，加入含血清的培養(yǎng)液，輕輕吹打制成細胞懸液，計數(shù)并用培養(yǎng)液調整細胞密度。
3）、根據(jù)培養(yǎng)的細胞類型和實驗要求，用吸管吸取一定量的細胞懸液，加到培養(yǎng)瓶中。對于需要特殊底物的細胞，要先將底物涂一層于培養(yǎng)瓶皿底壁，然后接種細胞。
4)、將培養(yǎng)瓶放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)。
5）、每隔2到3天更換培養(yǎng)液一次或根據(jù)培養(yǎng)液顏色的變化確定換液時間。
（2）注意事項
1)原代培養(yǎng)的分離細胞在初次接觸體外環(huán)境時，雖然被分散成單個細胞，但它們之間的互相影響還是存在的，而且這種影響對細胞能否存活是非常重要的。在這些細胞之間能產生一些促生長的活性物質，使細胞彼此互相促進存活和生長。如果接種的細胞密度過低，細胞之間的促生長作用很小，雖然營養(yǎng)物質很充足，也很難使細胞適應從體內的組織環(huán)境到被分散后進入獨立生存環(huán)境的變化過程。如果接種的細胞密度過大，會導致營養(yǎng)物質供應不足，代謝廢物積累較快需要經常換液和傳代。
 
2）原代培養(yǎng)時初始培養(yǎng)在組織分散和分離細胞時細胞可能會受到嚴重的損傷。適當增大原代培養(yǎng)接種的細胞密度，給培養(yǎng)的細胞提供更多的類似于在體內時細胞之間的相互作用，會極大提高原代培養(yǎng)的細胞在體外存活率。待細胞適應體外環(huán)境后進行傳代培養(yǎng)時再以較低的密度接種和培養(yǎng)。
3）由于細胞之間的相互的內在聯(lián)系被打破，分離細胞在體外培養(yǎng)時經歷的生存環(huán)境改變很大，在體外存活和生長的難度相應增加。對于貼壁依賴性細胞來說，盡快使接種的細胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關鍵。可以在接種后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3h到5h，由于細胞懸液中帶有少量培養(yǎng)液，細胞即可以維持存活，又可以很快接觸到培養(yǎng)瓶底壁，是細胞迅速黏附于底物，待細胞貼壁后，再補足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
3、分離細胞培養(yǎng)法—懸浮型細胞培養(yǎng)
（1）操作過程
1）制備細胞懸濁液，計數(shù)并用培養(yǎng)液調整細胞密度。
2）在培養(yǎng)皿中加入足夠的培養(yǎng)液。
3）將欲接種的細胞接種到培養(yǎng)器皿中。
4）在培養(yǎng)皿內放入一個有聚四氟乙烯包被的磁棒。將培養(yǎng)皿封口，送入恒溫箱內。在磁力攪拌器上邊攪拌邊培養(yǎng)。若接種培養(yǎng)瓶或試管中，封口后可將培養(yǎng)器皿固定在恒溫搖床上，邊搖動邊培養(yǎng)，無需放置磁棒。有些細胞也可以不用磁棒或磁力攪拌器，也不必使用恒溫搖床，接種于預先用硅脂包被的培養(yǎng)器皿內直接在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)即可。
5）培養(yǎng)液略呈黃色換液。吸出部分舊培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液即可。
（2）注意事項
1）進行懸浮細胞培養(yǎng)時必須保持細胞的懸浮狀態(tài)。可以通過增加培養(yǎng)液的黏度來幫助細胞呈懸浮狀態(tài)，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質酸復合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內加入培養(yǎng)液是，以5ml為**低限度，否則攪拌時會產生氣泡對細胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過快，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下，可以采用旋轉瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細胞換液時要注意不要吸出細胞。#p#分頁標題#e#
2）能夠進行懸浮培養(yǎng)的細胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營養(yǎng)成分消耗大，換液時間隔一般較短。
（二）原代培養(yǎng)的注意事項
1、在原代培養(yǎng)的1天到2天內，要特別注意觀察是否有細菌、真菌的污染，一旦發(fā)現(xiàn)，要及時清除，防止造成其它細胞的交叉感染；
2、隨著培養(yǎng)的進程，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質被逐漸的消耗，營養(yǎng)成分越來越少，細胞代謝產物越來越多，有細胞呼吸過程中釋放出來的CO₂及其它產物如乳酸、丙酮酸等也逐漸增加。隨著酸性物質的增加，培養(yǎng)液中的pH值越來越低，培養(yǎng)液的顏色也越來越黃。因此，在細胞培養(yǎng)的過程中，要注意培養(yǎng)液顏色的變化，并根據(jù)培養(yǎng)液的顏色來決定換液時間。正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色；當培養(yǎng)液呈橙黃色時，細胞一般生長情況良好；呈淡黃色時，可能培養(yǎng)時間較長，營養(yǎng)不足，死亡細胞較多；呈紫紅色時，可能是細胞生長狀態(tài)不好或已經死亡。所以，應在培養(yǎng)液略黃時吸出部分舊培養(yǎng)液，然后補加同等數(shù)量的新鮮培養(yǎng)液。換液過程中，不要吸出細胞，不要使培養(yǎng)液溢出培養(yǎng)瓶，避免各種微生物的污染。換液時，應將培養(yǎng)液事先預溫**37℃。
一般培養(yǎng)**，組織細胞即可在培養(yǎng)瓶皿底壁黏附并貼壁生長。2天到3天后，細胞恢復增殖活動。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量逐漸增多，消耗的營養(yǎng)物越來越多，需要換液的時間越來越短，當細胞逐漸長滿培養(yǎng)瓶壁并形成一單層細胞時，細胞之間相互發(fā)生接觸和聯(lián)系，逐漸產生接觸抑制作用，培養(yǎng)物生長速度減慢。當培養(yǎng)物**后形成一層完整的細胞單層時，生長幾乎停止。在細胞高達80%融合時就需要進行傳代了。
二、傳代培養(yǎng)
(一)傳代培養(yǎng)的過程
1、組織塊培養(yǎng)物的傳代過程
基本操作過程：
（1） 將原代培養(yǎng)物連同底物蓋玻片一同取出，置于無菌的培養(yǎng)皿上。
（2） 用刀將培養(yǎng)物分割，刮去多余的部分，剩余繼續(xù)培養(yǎng)的部分。一般是分割刮去組織塊外圍的部分組織，留下中央的部分組織繼續(xù)培養(yǎng)。或部分分割并挑去組織塊，留下遷移出來的細胞于底物蓋玻片上繼續(xù)培養(yǎng)。也可以將組織塊挑出，再種植于新的底物蓋玻片上繼續(xù)培養(yǎng)。
（3） 給剩余的培養(yǎng)物加上培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
2、分離細胞培養(yǎng)物—貼壁型細胞的傳代過程：有兩項核心工作：一是分割培養(yǎng)物，二是再接種。
基本操作過程：
（1） 取出培養(yǎng)瓶，打開瓶蓋，用吸管吸出舊的培養(yǎng)液。
（2） 用無Ca²⁺、Mg²⁺的平衡鹽溶液輕輕漂洗培養(yǎng)物1次到2次，洗去殘余血清后棄去平衡鹽溶液。
（3） 在培養(yǎng)皿內加入胰蛋白酶溶液，室溫下消化5min到15min顯微鏡下觀察細胞突起縮回近似圓形、細胞之間的間隙增大時停止消化。
（4） 吸管吸去消化液后立即加入含血清培養(yǎng)液或蛋白酶抑制劑，抑制胰蛋白酶的活性，使消化終止。
（5） 用彎頭吸管吸取培養(yǎng)皿內的培養(yǎng)液反復吹打瓶皿底壁，使已經消化的細胞脫離瓶皿底壁。
（6） 低速離心，棄去上清液。
（7） 用新鮮培養(yǎng)液將細胞沉淀重新懸浮，計數(shù)并調整細胞密度。
（8） 根據(jù)傳代目的將細胞懸浮液接種到一個或多個新的培養(yǎng)器皿中。
3、分離細胞培養(yǎng)物—懸浮型細胞的傳代過程
基本操作過程：
（1） 將培養(yǎng)物移入離心管低速離心。根據(jù)傳代目的將細胞懸液接種在一個或多個新的培養(yǎng)皿中。
（2） 用吸管吸去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液使細胞沉淀重新懸浮
（3） 根據(jù)傳代目的將細胞懸液接種在一個或多個新的培養(yǎng)皿中。
（4） 加足培養(yǎng)液，加蓋封口，加入恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
（二）傳代培養(yǎng)的注意事項
1、離體培養(yǎng)的細胞生命力比較脆弱，因此傳代時細胞沒有生長到培養(yǎng)瓶底壁面積的80%以前，不要急于傳代。
2、**傳代，由于原代培養(yǎng)中各種類型的細胞常混雜生長，傳代時不同細胞又不同的消化時間，因而要根據(jù)需要注意及時處理。
3、對貼壁細胞消化后的吹打過程要有序進行，要從一邊開始到另一邊結束，尤其是器皿的四角處，確保瓶皿底壁各處的細胞都被吹打脫離。吹打時動作不宜過猛，吹出液體的力度要適中，否則會直接損傷細胞并產生能傷害細胞的氣泡。
4、對于貼壁能力較弱，容易脫壁的細胞，可以不經蛋白酶原消化處理和終止消化這兩步，直接對原代培養(yǎng)物或經漂洗后用吸管進行吹打使細胞脫離瓶皿底壁。這種直接吹大的方法對生命力旺盛的細胞如某些腫瘤細胞較為合適。高強度機械吹打易對細胞造成傷害較大，細胞也常有較大數(shù)量的丟失，因而jue大部分貼壁生長的細胞需消化后才能吹打，一般不單獨采用高強度機械吹打。
5、**傳代時適當增大接種的細胞密度，使培養(yǎng)的細胞間盡快發(fā)生相互作用，有利于傳代細胞的存活。
6、傳代數(shù)是指對培養(yǎng)物傳代的次數(shù)，它不等于細胞分裂的次數(shù)或細胞的代數(shù)，而僅代表傳代操作的次數(shù)。
7、傳代對細胞的影響或傷害程度僅次于將活細胞從生物體內取出并進行原代培養(yǎng)的程度。只是因為傳代后的細胞生長并不像剛開始原代培養(yǎng)時那樣緩慢罷了。
8、每經過一次傳代，細胞的生長環(huán)境就相應發(fā)生一次較大變化。體外生長的細胞若處于動蕩的生活環(huán)境中，細胞的遺傳特性往往容易發(fā)生改變。經過多次傳代培養(yǎng)的細胞，往往容易轉化為惡性細胞。因此，傳代對細胞生長和性狀會產生不利影響，一般情況下要盡可能減少傳代次數(shù)。#p#分頁標題#e#